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植物组织培养技术简介南师大生科院实验教学中心常福辰

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目录

一、绪言

二、植物组织培养的定义及其基本原理

三、植物组织培养的类型

四、植物组织培养的应用

五、植物组织培养室的建设

六、植物组织培养相关知识

七、植物组织培养实验流程

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一、绪言

植物组织培养是一门以课堂讲解与实验技术相结合的专业基础课。课堂讲授主要介绍植物组织培养的概况、基本实验设备的使用方法; 植物组织培养应用原理及基本操作技术;植物愈伤组织的诱导;分别以茎尖、花粉花药、胚胎作为外植体的培养技术等内容。实验主要以植物愈伤组织的诱导内容为主线,将培养基母液的配制、培养基配置、继代培养等实验技术方法穿插在其中。

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二、植物组织培养的定义及其基本原理

植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。

植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要应用前景。

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二、植物组织培养的定义及其基本原理

植物的组织培养是基于高等植物细胞具有全能性，在高等植物细胞分化过程中，它们的遗传潜力并没有丧失，仍保持着潜在的全能性。已分化成熟的活细胞在一定的营养因素的作用下，有可能回复遗传全能性，类似合子的发育功能，由单细胞发育成为胚状体，继而形成完整的植株。利用这一原理进行的植物试管快速繁殖，现已广泛的应用于生产实践中。

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三、植物组织培养的类型

1、根据培养层次分为：植株培养、器官培养、胚胎培养、愈伤组织培养、细胞培养、原生质体培养。

2、根据工程技术策略分为：组织与细胞培养、细胞融合、胚胎工程、染色体工程、细胞遗传工程。

3、根据植物领域应用目的分为：植物快速繁殖培养技术、获得特殊倍性的细胞工程技术、获得特殊杂种的细胞工程技术、用于基因功能研究的细胞工程技术。

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四、植物组织培养的应用

1、在植物育种上的应用

快速获得特殊倍性材料：花药和花粉培养可获单倍体，加倍后获得纯合材料，大大缩短育种周期；胚乳培养技术可获得三倍体，用于无核果实植物育种中。

克服远缘杂交不亲和：原生质体融合技术获得亲缘关系相差很远的两亲本间的细胞杂种，不仅克服远缘杂交不亲和，而且有可能创造新品种。

克服杂种胚早期夭折：远缘杂种胚和某些果树（柑橘、早熟桃）的胚常常早期夭折，利用幼胚培养技术可以克服。

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1、在植物育种上的应用

导入外源基因：细胞工程技术可以进行细胞器转移、基因转移、染色体转移等，实现外源基因的导入。

突变体筛选：细胞培养和原生质体培养中，常发生自发的遗传变异，是十分广泛的变异来源，同时培养中人工诱变，变异频率大大提高，增加了突变体的筛选机会。

种质资源保存：组织培养技术保存植物种质，节约人力、物力和耕地，避免不可预测因素对种植资源造成损失。

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2、脱除病毒，幼化复壮植物的应用

植物病毒是引起无性繁殖作物品种退化的主要因素。病毒防治除抗病育种外，脱除种苗所携带的病毒是目前最有效的途径。利用茎尖培养脱毒进行无病毒种苗的快速繁殖，已大量应用。同时利用组织培养技术使传统上繁殖系数很低的有性繁殖植物得以快速繁殖，大大提高了经济效益。

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3、在有用次生产物生产上的应用

利用细胞的大规模培养可生产一些有用次生产物。目前通过细胞培养的植物种类已达100多种，所能鉴别的成分有300种。主要集中在价格高、栽培困难、产量低、需求大的药品上，其它次生代谢产物如香料、食品调味剂、染料和树胶。

利用植物生产有用次生产物，能够节约大量耕地、保护生态环境、提高生产效率，生产医药原料其含量稳定性会更好，有利于中药植物医药事业的发展。

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4、在细胞生物学和发育生物学研究中的应用

利用原生质体系统在植物细胞分裂周期调控、细胞分化等进行细胞生物学领域的研究；通过细胞工程途径，在细胞壁生物学等特殊领域进行研究。

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5、在植物遗传、植物病理等基础研究中的应用

花药、花粉培养的植株是研究细胞遗传的好材料。

细胞培养和组织培养为研究植物生理活动和病理活动等提供了理想技术体系。

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五、植物组织培养室的建设

实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。

实验室组成：化学实验室（准备室） 、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室等。

其中化学实验室主要用于各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。

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主要设备：

高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）、超净工作台、冰箱、电子天平（或分析天平）、蒸馏水器、酸度计等设备。其它还有酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）、药品柜、防尘橱（放置培养容器）、及常用的培养基配制用玻璃仪器，培养瓶等。 

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六、植物组织培养相关知识

（一）培养基的主要种类

目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：1. MS培养基? 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。

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（一）培养基的主要种类

2. B5培养基? 是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。

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（一）培养基的主要种类

3. White培养基? 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适用于生根培养。

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（一）培养基的主要种类

4. N6培养基? 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。???

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（二）培养基的成分?

组织培养过程中，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的。因此，培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。所有这些物质，可概括为5大类 。??? ???? ????? ??? 

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1．无机营养物

?? 植物生长必须的有13种元素：氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、硫（S）、铁（Fe）、硼（B）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、钼（MO）、氯（Cl）。前六种属大量元素，后七种属微量元素。培养基的各种盐类中均含有上述这些元素。???

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1．无机营养物

无机氮可以两种形式供应，即硝态氮和铵态氮。有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。

铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，目前皆用螯合铁，即硫酸亚铁加乙二胺四乙酸钠配成。

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2．有机物质

? 主要有两类：一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢、氧、氮等必要元素，如糖类（蔗糖、葡萄糖和果糖）、氨基酸及其酰胺类（如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺）；另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用，如硫胺素（B1）、吡哆醇（B6）、烟酸、生物素、肌醇、单核甘酸及其碱基（如腺嘌呤等）。

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3．植物生长刺激物质

主要加入植物天然的五类激素物质及其人工合成的类似生长激素物质，如生长素中常用的吲哚乙酸、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸；细胞分裂素中常用的有激动素、6-苄基氨基嘌呤、玉米素；赤霉素类中常用的有赤霉酸；乙烯类中常用的有乙烯和乙烯利。

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4．其他附加物

这些物质不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益。包括人工合成和天然的有机物，常用的有酵母提取物、椰乳、果汁等及相应的植物组织浸出液。对细胞和组织的增殖和分化有一定促进作用。此外琼脂在组培中作为凝固剂，是外植体的支持体。

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（三）相关知识

外植体（explant）-----由活体（in vivo）植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。

脱分化（dedifferentiation）-----将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。

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（三）相关知识

再分化（redifferentiation）-----经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。

愈伤组织（callus）-----在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。

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（三）相关知识

胚状体-----由愈伤组织或表面形成的许多类似胚的突起，是初步分化的幼小生命体，芽根有共同的维管束，是双极性结构，起源于单细胞，无嵌合现象，结构完整，可直接形成小植株，成苗率高，去分化难，再分化也很难。

丛生芽-----由植物器官和愈伤组织发育出来的群体丛生芽苗，大多是多细胞形成，双极性，结构完整，可直接形成小植株，成苗率高，去分化容易，再分化中等。

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（三）相关知识

空白培养----主要用于无菌外值体的建立阶段，只含糖不加任何营养元素的培养。

初代培养----最初组织培养的阶段。

继代培养----为了快速繁殖，不断重复利用同一种培养基转瓶培养的过程 。

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七、植物组织培养实验流程

Ⅰ 外植体材料的培养和预处理

实验目的

熟悉植物离体快繁技术对外植体材料的要求，掌握材料培养和预处理的方法。

实验原理

经水培萌发的新芽，因光照弱，长得幼嫩，表面光滑，是组织培养的理想外植体。

仪器设备、材料试剂

光照培养箱、烧杯、刀片。

桑树一年生枝条。

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Ⅰ 外植体材料的培养和预处理

实验步骤

冬季1-2月份从桑树基部采集健壮、萌发的一年生枝条，剪成30-40cm长的枝段，用水浸泡并冲洗干净，置烧杯中水培。每天换水一次，光照强度10000-15000Lx、光照时间8-10h/d、温度15-20℃。

培养7-10d可见枝条上的腋芽萌动，30-40d后，待新芽长至1-4cm，即可作为组织培养的外植体材料。

培养后期注意勿使水溅上枝条，以免滋生杂菌不利于灭菌处理。

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Ⅱ MS培养基贮备液的配制

实验目的

熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法。

实验原理

MS培养基是一种最常用的植物离体培养基。为简便起见，常将培养基配方中的试剂按照一定倍数一次称量，配制成具有一定倍数的浓缩贮备液，以供一段时间使用。

仪器设备、材料试剂

天平、称量纸、烧杯、量筒、药匙、蒸馏水、洗瓶、容量瓶、pH试纸、试剂瓶（棕）、搅拌器、加热设备、玻棒、标签纸、滴管、各种试剂、1N NaOH、1N HCl

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Ⅱ MS培养基贮备液的配制

四、实验步骤

称量→溶解→（混合）→（调pH值）→定容。

MS培养基贮备液组成（mg/L）见表1：

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表1、MS培养基的组成

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【注意事项】

1. 实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败。

2. 配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月。

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【注意事项】

3. 由于多数激素难溶于水，它们的配法如下：??? 1） IAA 、IBA 、GA3需先溶与少量95%酒精中，再加水定容到一定浓度。??? 2） NAA可溶于热水或少量95％的酒精中，再加水定溶到一定浓度。??? 3） 2，4－D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。??? 4） KIN和BA先溶于少量1mol的HCl中，再加水定容。??? 5） 玉米素先溶于少量95％酒精中，再加水至一定浓度。

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Ⅲ 茎芽增殖培养基的设计与配制

实验目的

学习、掌握茎芽增殖培养基的设计、配制方法。

实验原理

在植物离体培养中，细胞分裂素类激素促进腋芽的萌发与生长，诱导不定芽的分化。

仪器设备、材料试剂

天平、称量纸、药匙、蔗糖、琼脂、烧杯、量筒、蒸馏水、加热设备、水浴锅、玻棒、移液管、各种贮备液、洗瓶、滴管、1N的NaOH、1N的HCl、pH试纸、标签纸、带盖塑料培养瓶、高压灭菌器

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Ⅲ 茎芽增殖培养基的设计与配制

方法步骤

每小组称取2 g琼脂和7.5 g蔗糖，置于烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积250 mL的3/4左右，加热使之溶解，并在80℃热水浴中保温。

分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV，然后按照需要的浓度分别加入激素。

补加蒸馏水，定容至1000ml 。

充分混匀后，用的1N的NaOH和的1N的HCl调节培养基的pH至5.8。

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Ⅲ 茎芽增殖培养基的设计与配制

将混合均匀的培养基分装到所选用的带盖塑料培养瓶中，每个培养瓶的装量不超过其最大容积的1/3。

拧好培养瓶的盖。

将装好培养基的培养瓶置高压灭菌器中，于121℃灭菌20 min。

灭菌结束后，将装有培养基的培养瓶从高压灭菌器中取出，置于水平台上，在室温下冷却，备用。

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【注意事项】

1. 实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败。

2. pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值。

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有关琼脂的性质

琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。琼脂条的用量在6—10g／L之间，琼脂粉的用量在3—4g／L之间。若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。

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有关琼脂的性质

加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。

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有关活性炭的介绍

活性炭（active carbon）可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5—l0g／L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。

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有关抗生素类

抗生物质(antibiotic)，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5—20mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果更好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。

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有关抗生素类

应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应。值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。

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Ⅳ 茎芽增殖培养的外植体的处理与接种

实验目的

学习、掌握茎芽外植体的处理、接种方法。

实验原理

选取水培腋芽为外植体；主要利用细胞分裂素促进腋芽的增殖。

仪器设备、材料试剂

桑树水培枝条。

超净台、镊子（大、小）解剖刀、培养皿、70%酒精棉球、酒精灯、火柴、酒精缸、工具架、废物缸、装有培养基灭过菌的培养瓶。

0. 1 %HgCl2，70%的酒精，无菌水。

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Ⅳ 茎芽增殖培养的外植体的处理与接种

方法步骤

将经湿热灭菌装有培养基的培养容器、接种用具等置于超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌处理30 min。

用干净刀片在水培枝条上切取连有新芽的茎段（芽长≥1. 5cm），置无菌水中，让其吸足水分。将无菌水连同新芽材料置超净台内。

坐到超净台前，用70%酒精棉球擦超净台面、操作者手、装有茎段的容器外壁等部分。

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Ⅳ 茎芽增殖培养的外植体的处理与接种

将材料从无菌水中取出，用70%的酒精处理3-4s，迅速置于水中一会儿，如此间歇重复处理2-3次。其表面被水全部湿润后，置0. 1 %HgCl2中灭菌4-5 min，用无菌水冲洗4-5次。

打开培养容器盖子，将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，盖好培养容器盖子，置于超净台上适当位置；对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。如此操作，直至完成。

接种完毕后，将培养瓶置于培养室中，光照强度4000-6000Lx、光照时间8-10h/d、温度24-28℃。培养25-30d，观察不同培养基中愈伤组织和丛生芽形成状况。

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【注意事项】

1、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死。

2、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7-10d的暗培养，然后再进行光照培养。

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Ⅴ 根再生诱导培养基的设计与配制

实验目的

学习、掌握根再生培养基的设计与配制方法。

实验原理

在植物离体培养中，生长素类激素促进根的再生。

仪器设备、材料试剂

天平、称量纸、药匙、蔗糖、琼脂、烧杯、量筒、蒸馏水、加热设备、水浴锅、玻棒、移液管、各种贮备液、洗瓶、滴管、1N的NaOH、1N的HCl、pH试纸、标签纸、带盖塑料培养瓶、高压灭菌器

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Ⅴ 根再生诱导培养基的设计与配制

方法步骤

每小组称取2 g琼脂和7.5 g蔗糖，置于烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积250 mL的3/4左右，加热使之溶解，并在80℃热水浴中保温。

分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV，然后1~8各小组再分别加入各自不同量的NAA（0；0.125；0.25；0.375；0.5；0.625；0.75；0.875 mg）。

补加蒸馏水至需配培养基的终体积250 mL。

充分混匀后，用1N的NaOH和1N的HCl调节培养基的pH至5.8。

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Ⅴ 根再生诱导培养基的设计与配制

将混合均匀的培养基分装到所选用的带盖塑料培养瓶中，每个培养瓶的装量不超过其最大容积的1/3。

拧好培养瓶的盖。

将装好培养基的培养瓶置高压灭菌器中，于121℃灭菌20 min。

灭菌结束后，将装有培养基的培养瓶从高压灭菌器中取出，置于水平台上，在室温下冷却，备用。

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Ⅵ 试管芽苗再生根的诱导

实验目的

学习、掌握试管芽苗再生根的诱导方法。

实验原理

选取合适试管芽苗为外植体，进行适当处理；主要利用生长素促进芽苗的生根。

仪器设备、材料试剂

桑树试管苗、超净台、镊子（大、小）、解剖刀、培养皿、70%酒精棉球、酒精灯、火柴、酒精缸、工具架、废物缸、装有培养基灭过菌的培养瓶。

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Ⅵ 试管芽苗再生根的诱导

方法步骤

将经湿热灭菌装有培养基的培养瓶、接种用具等置于超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌处理30 min。

坐到超净台前，用70%酒精棉球擦超净台面、操作者手和臂、装有试管苗培养瓶的外壁等部分。

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Ⅵ 试管芽苗再生根的诱导

装有试管苗的培养瓶中取出无菌苗，置于无菌的培养皿中（的无菌滤纸上），用灭过菌的刀和镊子配合操作，从其基部将新生芽苗切下。打开培养瓶的盖子，将所切芽苗按其自然极性方向垂直插入培养基，盖好培养瓶盖，置于超净台上适当位置；对接种用具等进行适当灭菌处理，继续接种完成。

转接后的无菌苗仍置于培养室中，光照强度40000-60000Lx、光照时间8-10h/d、温度24-28℃。培养10d左右，定期观察不同培养基中无菌苗生根状况。

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Ⅶ 试管苗的移栽

实验目的

学习、掌握试管试管苗移栽方法。

实验原理

诱导生根的无菌苗经炼苗处理后，可移栽到自然条件下生长。

仪器设备、材料试剂

根系较发达的试管苗、培养室、周转箱、塑料布、蛭石。

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Ⅶ 试管苗的移栽

方法步骤

适当遮荫培养2-3d (光照控制在10 000-20 000 Ix)。其他培养条件不变。

常规培养（光照40 000-60 000 lx) 5-6d，待试管苗叶片绿色加深，叶面较干燥，保护组织开始形成，这时即可打开瓶口取出试管苗，洗去琼脂后立即移栽。

室温下移栽，栽于塑料周转箱中(以蛙石作介质)，用塑料布遮盖保温，湿度控制在80%以上(每天雾状喷水一次)，温度保持在20-28℃。定期观察移栽苗的生长状况。

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